Gene Editing and Molecular Biology (GEMBio)

La facility di gene editing e biologia molecolare (GEMBio) offre servizi di supporto all’attività di ricerca scientifica, didattica, e di terza missione dell’Ateneo nel campo della biologia molecolare e della regolazione dell’espressione genica.

 

La facility GEMBio (diretta dal prof. Marco Trerotola, Unità di Patologia Oncologica, Laboratorio di Medicina Molecolare) può supportare le diverse esigenze dei ricercatori nel campo della biologia molecolare, dai protocolli standard di sottoclonaggio genico alle tecnologie più recenti per la regolazione mirata dell’espressione genica (tra cui RNA interference e gene editing mediato da CRISPR/Cas9).

 

I servizi della facility GEMBio si applicano a diversi ambiti scientifici, in particolar modo alle scienze biomediche, e vengono resi ad enti pubblici e privati, sia in ambito nazionale che internazionale, attraverso collaborazioni scientifiche e consulenze progettuali, oppure mediante modalità fee-for-service e conto terzi.

 

Alcuni dei principali servizi offerti dalla facility GEMBio sono elencati di seguito.

 

  1. CRISPR/Cas9 editing per inattivazione funzionale di geni target

 

Il servizio comprende:

(1) disegno e sintesi di n.3 coppie di oligonucleotidi sgRNA per ogni gene target da inattivare;

(2) annealing delle coppie di oligonucleotidi sgRNA;

(3) inserimento degli oligonucleotidi sgRNA in plasmidi lentivirali specifici;

(4) sequenziamento dei plasmidi ricombinanti;

(5) trasfezione di cellule packaging (HEK-293T) per generazione di virioni ricombinanti;

(6) raccolta di supernatante da HEK-293T contenente i virioni ricombinanti;

(7) trasduzione di cellule target (fornite dall’utente);

(8) selezione di cellule resistenti ed espansione di cloni di cellule singole (3 x 96-well plates per ogni sgRNA);

(9) estrazione di DNA genomico da almeno 10 cloni cellulari per ogni sgRNA;

(10) sequenziamento della regione sottoposta a editing;

(11) analisi bioinformatica dei DNA sequenziati;

(12) espansione dei cloni cellulari positivi (almeno 3 per ogni sgRNA).

 

  1. Proteine chimeriche fluorescenti

 

Il servizio comprende la realizzazione di chimere fluorescenti di geni target fusi a varianti spettrali della green fluorescent protein (GFP) o della red fluorescent protein (RFP). All’utente è richiesto di fornire il gene di interesse e la corrispondente sequenza in formato elettronico. La facility GEMBio provvederà all’amplificazione mediante PCR, ed al sottoclonaggio nei vettori di destinazione richiesti.

 

  1. Mutagenesi sito-specifica

 

All’utente è richiesto di fornire il gene di interesse all’interno di un vettore plasmidico, per la successiva modifica (mutazioni puntiformi, inserzioni/delezioni di triplette) mediante tecnologia Q5 site directed mutagenesis. La facility GEMBio fornirà all’utente il vettore contenente il gene di interesse mutato, previa verifica dell’avvenuta mutagenesi mediante sequenziamento Sanger.

Presto disponibile anche la tecnologia Base-editing basata su CRISPR, per l’introduzione di mutazioni sito-specifiche nel genoma delle cellule target.

 

  1. RNA interference

 

Inibizione stabile dell’espressione di geni target, basata sull’utilizzo di shRNA. All’utente è richiesto di fornire la sequenza del gene di interesse, e la facility GEMBio provvederà al disegno di n.3 coppie di  oligonucleotidi shRNA per ogni gene da silenziare. Tali oligonucleotidi verranno poi inseriti in specifici vettori plasmidici. La facility GEMBio provvederà al sequenziamento dei plasmidi ricombinanti, e fornirà all’utente n.3 prodotti corrispondenti alle 3 coppie di oligonucleotidi disegnate per lo specifico esperimento di silenziamento.

 

  1. Plasmidi “ready-to-use”

 

La facility GEMBio possiede una collezione di vettori di espressione per proteine (native, mutate, tagged, fluorescenti etc.) esprimibili in batteri o in organismi superiori (una lista completa ed aggiornata sarà periodicamente pubblicata sul sito web del CAST), ed utilizzabili per lo studio del signaling molecolare, per la marcatura di organelli e regioni specifiche dell’ambiente cellulare, per produzioni eterologhe e per analisi biochimiche avanzate (interazioni proteina-proteina). La distribuzione di tali vettori è soggetta alle limitazioni di Material Transfer Agreement che verranno implementate con i singoli utenti finali.

STAFF

Marco Trerotola

Marco Trerotola, PhD

Professore Associato, MED/46
Responsabile della Facility

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Ludovica Pantalone
Ludovica Pantalone

Tecnico di Laboratorio
Borsista

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